Validated method of nicotine and cotinine determination after sub-acute inhalation of electronic cigarette vapors in mice using ultra performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry

Abstract

Study main question: What are the most appropriate conditions of UPLC-MS/MS analysis to detect and determine nicotine and cotinine in mice serum samples exposed to e-cigarette-vapors-containing nicotine using hydralazine as an internal standard?

Study sub-questions:1- How correct and accurate is the method according to the standards of legislative and regulatory bodies?2- Are there any differences between the concentrations of nicotine or cotinine in the serum of mice exposed to e-cigarette vapor for four weeks and the gender of these mice?

Study main objective:The main objective of our study is to detect and validate the levels of nicotine and cotinine in the serum of male and female mice exposed to e-cigarette vapors-containing nicotine for 4 weeks using UPLC-MS / MS.

Study sub-objectives:1-To validate an UPLC-MS / MS method for analysis of nicotine and cotinine in mice serum samples using hydralazine as an internal standard. 2- Determining the differences between the concentrations of nicotine or cotinine in the serum of male and female mice exposed to nicotine-containing e-cigarette vapors for 4 weeks and the gender of these mice.

Study methodology: The experimental method and its tools are testing and analyzing according to laboratory standards.

Study samples: The study was conducted on male and female black mice (C57BL / 6J mice) with weights of (23-27) grams - at the Animal Research Center - College of Pharmacy - King Saud University, and these experiments were approved by the Scientific Research Ethics Committee at the University King Saud.

Result: The concentration of nicotine and cotinine was measured following published work(Kaisar et al., 2017; Stolker et al., 2003). The results showed that the methodologyappliedhas highly efficient properties in terms of detection, estimation and extraction, where theminimum limit of quantification (LOQ) was (10 ng/ml). The linearity of this analytical methodologywasin the range of (10-1000 ng/mL) and the correlation coefficientwas (r2> 0.99) for both compounds.The average recovery rate of the real valueswere101.6% ± 1.33 for nicotine and 100.4% ± 0.54 for cotinine, while the precision and accuracy for cotinine and nicotine were less than 6.1. After obtaining these information forthe analytical methodology with acceptable validity for theapplied criteria, the study was conductedusing female and malemice serum samples after a 4-week inhalation of e-cigarette vapors-containing nicotine.Improved linearity (r2>0.99) was also observed for nicotine on the range of10-1000 ng/mL and for cotinine on the range of10-1000 ng/mL with aliquots as low as 50 μl of mice serum sample. The levels of both nicotine and cotinine were determined in both gendersand the results were similar and there was no significant difference in the level of nicotine in the serum between male and female mice that were exposed to e-cigarette vapors-containing nicotine for 4 weeks, while the level of cotinine was higher in males.

1. The presented method is simple and has an acceptable sensitivity, so it is recommended to be applied in forensic and clinical toxicology laboratories. 2. The serum concentrations of nicotine metabolites may be different between males and females.

التساؤل الرئيسي: ماهي انسب ظروف تحليل UPLC-MS/MSلكشف وتحديد النيكوتين والكوتينين في عينات مصل الفئران المعرضة لبخار السجائر الالكترونية المحتوية على النيكوتين باستخدام الهيدرالازين كمعيار داخلي؟

التساؤلات الفرعية: 1- مامدى صحة الطريقة ودقتها وفقا لمعايير الهيئات التشريعية والتنظيمية؟2- هل هناك فروقات بين تراكيزالنيكوتين أوالكوتينين في مصل الفئران المعرضة لبخار السجائر الالكترونية لمدة أربعة أسابيع وجنس تلك الفئران؟

الهدف الرئيسي: الهدف الرئيسي من دراستنا هو الكشف عن مستويات النيكوتين والكوتينين في مصل ذكور وإناث الفئران التي تعرضت لأبخرة السجائر الإلكترونية المحتوية على النيكوتين لمدة 4 أسابيع باستخدام UPLC-MS/MS.

الأهداف الفرعية: 1- معرفة اذا كان UPLC-MS/MS قادر على تحديد مستويات النيكوتين والكوتينين في عينات دم الفئران باستخدام الهيدرالازين كمعيار داخلي.2 - تحديد الفرق بين تركيزات النيكوتين أوالكوتينين في مصل ذكور واناث الفئران التي تعرضت لأبخرة السجائر الإلكترونية المحتوية على النيكوتين لمدة 4 أسابيع وجنس تلك الفئران.

منهج الدراسة: المنهج التجريبي وادواته هي الاختباروالتحليل المضبوطة وفق المعايير المخبرية.

عينة الدراسة: تم إجراء الدراسة على ذكور وإناث الفئران السوداء (C57BL/6J mice)ذات أوزان (23- 27)جرام-في مركز أبحاث الحيوانات- كلية الصيدلة- جامعة الملك سعود،وتمت الموافقة على هذهالتجارب من قبل لجنة أخلاقيات البحث العلمي بجامعة الملك سعود.

نتائج الدراسة: أوضحت نتائج الدراسة أن الطريقة المستخدمة تمتلك كفاءة عالية من ناحية الكشف والتقدير والاستخلاص حيث وجدت الدراسةأن حد التقدير الكمي(LOQ) هو 10نانوغرام / مل ، ومجال خطية الطريقة التحليلية يكون ضمن 10-1000 نانوغرام / مل لكلا المركبينومعــامل الارتبـــاط(r2> 0.99)ولوحظ أنمتوسط نسبة الاسـتـرداد من القيــــمة الحقيقية كانت101.6% ± 1.33 للنيكوتين و 100.4 ± 0.54 للكوتينين. أما قيم الانضباط و الدقةفكانت أقل من 6.1. بعد الحصول على صلاحية مقبولة كطريقة تحليلية باستخدام المعايير المدروسة، تم استخدامها على عينات مصل الفئران من الإناث والذكور بعد 4 أسابيع من استنشاق أبخرة السجائر الإلكترونية التي تحتوي على النيكوتين. كما أوضحت الدراسة الخطية الجيدة (r2> 0.99) للنيكوتين على مدى 0.01 - 1 ميكروغرام / مل وللكوتينين فوق النطاق 0.01 - 1 ميكروغرام / مل بكمية قسمة منخفضة تصل إلى 50 ميكرولتر من مصل الفئران وقد تم تحديد مستويات كلاً من النيكوتين والكوتينين في كلا الجنسين (ذكور واناث) وكانت النتائج مقاربة ولا يوجد فرق ملحوظ في مستوى النيكوتين في المصل بين ذكور وإناث الفئران التي تعرضت لأبخرة السجائر الإلكترونية المحتوية على النيكوتين لمدة 4 أسابيع بينما كان مستوى الكوتينين مرتفع عند الذكور.

التوصيات: 1. الطريقة المقترحة سهلة و ذات حساسية مقبولة لذا يوصى بتطبيقها في معامل السموم الجنائية والسريرية . 2. تراكيز نواتج أيض مركب النيكوتين في المصل قد يكون مختلف بين الذكور والاناث.